液相色譜中“體積”是什么意思？

來源：安捷倫

大家在閱讀液相色譜的文章的時候，經常能夠看到各種名字的“體積”，比如死體積、駐留體積、延遲體積、孔隙體積等等，這些“體積”到底都是些什么東西？它們對我的液相分析到底意味著什么呢？今天我們就看一看經常用到的這三個體積。

死體積

死體積定義

指的是有效進樣點到有效檢測點之間排除色譜柱中包含固定相部分的體積。包括 4 部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內固定相顆粒間隙（被流動相占據， Vm ）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有 Vm 參與色譜平衡過程，其他3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。

系統死體積一般通過進樣基本不保留的小分子來測定。尿嘧啶、丙酮和硫脲是反相色譜中最常用的測試物質；死時間與死體積相關；可以用死體積除以流速測定。

 死體積計算

對于HPLC來說，該如何計算死體積呢。

死體積(dead volume,V0)——由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內固定相顆粒間隙（被流動相占據，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。

死時間(dead time,t0)——不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。

測量系統死體積通常需要通過實驗進行測量，常用方法是通過進一針和色譜柱固定相沒有任何作用的特殊溶液時，就會得到一個色譜峰，由此峰可以測得死時間（t0），這就是t0的實測結果。

然后通過計算得到系統死體積:

死體積（V0) = 死時間t0×流動相的流速F。

減少死體積

在我們使用或維護的過程中，如果涉及管路等配件的更換，應該選擇與原規格一致的配件，以確保死體積與原來一致，避免死體積的增加而帶來峰形的展寬。

接裝色譜柱時，需確保管線接頭匹配完好（特別注意peek管接頭的使用，以及管線與色譜柱的連接處）避免形成接頭空腔（如下圖）。

 那什么時候應選擇哪種接頭？

PEEK 和聚酮接頭尤為適用于需要經常更換的連接，或需要生物兼容性時。也在對壓力要求不高時使用，如色譜柱的出口接頭。PEEK 接頭的最高使用壓力為 200 bar，聚酮接頭為 600 bar。

駐留體積

駐留體積的定義

駐留體積是指溶劑首次混合點（通常在液相色譜儀的混合腔內或比例閥中）與液相色譜柱頭之間的體積。其中，低壓混合系統的駐留體積等于從比例閥經泵和其他系統組件到柱頭的體積總和。高壓混合系統的駐留體積等于從溶劑首次混合點，經過兩個計量泵再到柱頭的體積總和。

在等度分離中，駐留體積對保留時間沒有任何影響，而在梯度分離中則會造成重大影響。若不了解系統的駐留體積，可能會帶來嚴重影響，因為駐留體積有可能遠大于色譜柱體積。

相同色譜柱，不同儀器

若想在不同儀器上使用相同尺寸的色譜柱，往往需要考慮駐留體積這個問題，因為不同駐留體積的儀器使用同一方法也可能影響分析結果。在柱頭開始梯度洗脫時，需要確保通過色譜柱的流動相體積相同。如果流動相的體積不相同，結果也將不同。

若在兩個實驗室內對不同駐留體積的 HPLC 儀器使用相同的方法，運行結果很可能不完全相同，因為兩種（或多種）流動相混合形成梯度后，將在各個儀器的流路內經過一段不同的時間后方能到達柱頭。因此，進樣后受時間影響，分析物將通過不同的流動相組分，其保留時間和分離度也會受到影響。如果將梯度方法從一臺儀器轉移到另一臺儀器，保留時間會根據兩個系統的駐留體積發生變化。流路體積越接近，結果的一致性越高。

結果如有差異，可采用多種方法加以糾正。若儀器的駐留體積較小，可以通過增加儀器的體積來調節駐留體積；若儀器的駐留體積較大，可以減小儀器連接管線的內徑和長度。此外，還可以在該方法中設置梯度延遲，以補償流路系統中的不同駐留時間。

延遲體積

延遲體積

延遲體積指的是溶劑混合點（通常在液相色譜儀的混合腔內或比例閥中）與 LC 柱頭之間的體積。

在梯度洗脫或等度洗脫的溶劑組成改變時，延遲體積對于使色譜柱在盡可能短的時間內完成流動相組成的變化非常重要。低壓混合物系統的駐留體積一般比高壓混合系統大。

減少延遲體積

由于不同儀器的延遲體積不同，在運行梯度方法時，可能會對分離度及保留時間造成影響，并進一步可能會對方法轉移或驗證造成影響。

延遲體積越大，可能造成的影響越大。越大的延遲體積，改變梯度比例后到達色譜柱的時間就越長，尤其是在低流速下。

減小不同滯留體積對分離效果影響的辦法主要有三種：

第一（最好的），某些系統控制器可以在梯度開始后的精確時間進樣。如延遲進樣時間tD，梯度和樣品可同時到達柱進口。

第二，如梯度過程開始可插入一段等度過程，用VD值較大的系統時則可以縮短這一過程；而用VD值較小的系統時則可延長這一過程。以此方式，樣品和梯度則會同時達到柱進口。

第三，以一較陡梯度從5%B至初始%B開始。